熒光原位雜交(FISH)

熒光原位雜交 (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) 是指利用熒光染料標(biāo)記的，已知序列的單鏈核酸作為探針，通過堿基互補(bǔ)配對原則，與待檢樣品中核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，然后通過觀察熒光信號，從而對樣品中待檢核酸進(jìn)行定性，定量及定位分析。FISH 具有快速，信號強(qiáng)，特異性高以及可以多重染色等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，基因組結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域。

影響FISH 結(jié)果的因素有很多，包括樣品準(zhǔn)備和處理，顯微鏡，光源，熒光探針以及濾光片。FISH 通常基于熒光顯微鏡來觀測信號，所用濾光片包括激發(fā)片，二向色鏡和發(fā)射片三種。其工作原理如下圖所示:

l                      激發(fā)片：選擇透過光源某部分波段的光，用來激發(fā)熒光探針；

l                      二向色鏡：反射光源的光至樣品，透過產(chǎn)生的熒光并反射激發(fā)光的散射光；

l                      發(fā)射片：選擇透過熒光的某部分波段的光至檢測器或人眼，并可以阻擋掉激發(fā)光的雜散光。

在 FISH 實(shí)驗(yàn)中，濾光片帶寬的大小會對 FISH 圖像的對比度產(chǎn)生重要的影響。增加帶寬會提高激發(fā)和接收效率，使接收的信號增強(qiáng)。但實(shí)際接收的信號中同時(shí)包含了探針的熒光信號和樣品的背底噪音，帶寬的增加會同時(shí)增加這兩者的強(qiáng)度。帶寬減小，雖然可以降低背底噪音的強(qiáng)度，但熒光信號也會隨之減弱 。所以對于對比度要求很高的FISH 實(shí)驗(yàn)，針對于每種具體的染料，都會存在一個(gè)*的帶寬，使 FISH 圖像能夠達(dá)到*的對比度。FISH 濾光片的帶寬都是根據(jù)常用的 FISH 染料做過優(yōu)化，可以為用戶的 FISH 實(shí)驗(yàn)提供*的圖像對比度。

"B" 的信號比"A" 多91%, 但是“B" 的噪音比“A" 多226%。“A"具有更好的對比度！

FISH 濾光片組具有以下特點(diǎn) :

l                      高透過率、高截止深度和高光譜陡度；

l                      保證足夠亮度的同時(shí)，提供*的圖像對比度；

l                      消除串色的影響；

a. 消除Gold 和Aqua 串色到Green 通道；

b. 消除Gold 和Orange 串色到Red 通道；

l                      對多波段濾光片組中的DAPI 通道進(jìn)行特殊處理，避免DAPI 信號過強(qiáng)而將其他通道信號掩蓋；

l                      多色圖像疊加零漂移；

l                      磁控濺射鍍膜，終身質(zhì)保。

ET 系列 - FISH 單波段帶通濾光片組

ET 系列 - FISH 多波段濾光片組

DAPI 是一種能夠與DNA雙鏈特異性結(jié)合的有機(jī)熒光染料。在 FISH 實(shí)驗(yàn)中，DAPI 主要用來對整個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行染色成像，這就導(dǎo)致了 DAPI 的濃度要遠(yuǎn)高于其他 FISH 探針的濃度。而在有些 FISH 實(shí)驗(yàn)流程中，DAPI 是在最后一步進(jìn)行染色，染色之后也沒有清洗的步驟。

在使用多波段濾光片進(jìn)行多色 FISH 實(shí)驗(yàn)中，為了避免DAPI 的信號將其他 FISH 探針的信號掩蓋，在 多波段濾光片組中，會刻意降低激發(fā)片在 DAPI 處的透過率，從保證 DAPI 的信號不至于過高（見下圖）。

DAPI 和 Aqua 的發(fā)射峰高度重疊，通常情況下同時(shí)做兩種探針的成像會很困難，因?yàn)榇罅康?/span> DAPI 信號會將 Aqua 信號掩蓋掉。

69014 濾光片組，通過降低 DAPI 的激發(fā)效率，能夠?qū)崿F(xiàn)DAPI，Aqua，Green 和 Orange 四色的同時(shí)觀察。 DAPI 和Aqua 采用不同的激發(fā)波段，但共享同一個(gè)接收通道（見下圖）。

ET 系列 - FISH 多波段濾光片組

1. 為保證 Green 和 Orange 強(qiáng)度接近，59011 適用于汞燈和鹵素?zé)艄庠矗?/span>59012 適用于 LED 光源；

2. 含一個(gè)雙波段激發(fā)片，用于同時(shí)激發(fā) Green 和 Orange；一個(gè)三波段激發(fā)片，用于同時(shí)激發(fā) DAPI，Green 和 Orange；三個(gè)單波段激發(fā)片，用于 分別激發(fā) DAPI，Green 和 Orange；

3. 含一個(gè)雙波段激發(fā)片，用于同時(shí)激發(fā) Green 和 Red；一個(gè)三波段激發(fā)片，用于同時(shí)激發(fā) DAPI，Green 和 Red；三個(gè)單波段激發(fā)片，用于分別 激發(fā) DAPI，Green 和 Red。